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課題1,微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

發(fā)布時(shí)間:2020-09-30 來(lái)源: 主持詞 點(diǎn)擊:

 專題 2 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用

 在繽彩紛呈的生物世界,微生物似乎顯得過(guò)于微小與沉寂。然而,它們?cè)谧匀唤鐓s作用非凡!

 生物學(xué)發(fā)展的歷史表明,諸多革命性地改變?nèi)祟悓?duì)生命的認(rèn)識(shí)的事件,都與微生物有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。例如,自然發(fā)生說(shuō)的破滅,酶的原始概念“酵素”的提出,肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明 DNA是遺傳物質(zhì),青霉素的發(fā)現(xiàn),第一個(gè)雜合 DNA分子的體外構(gòu)建„„ 在借助顯微鏡第一次直面微生物之后,一代又一代科學(xué)家建立、發(fā)展和完善了微生物技術(shù)。課題 1將帶領(lǐng)我們學(xué)習(xí)這些技術(shù)中最基本、最核心的微生物培養(yǎng)技術(shù)。在此基礎(chǔ)上,我們不妨也嘗試一下本專題中的其他課題。相信在逐步深入的探索中,你能充分體會(huì)到動(dòng)手動(dòng)腦做科學(xué)的樂(lè)趣。

 課題 1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) 課題背景 19 世紀(jì)中期,關(guān)系到法國(guó)經(jīng)濟(jì)命脈的釀造業(yè)曾一度遭受殷滅性的打擊。在生產(chǎn)過(guò)程中,出現(xiàn)了葡萄酒變酸、變味的怪事。經(jīng)過(guò)一番研究,法國(guó)科學(xué)家巴斯德發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致生產(chǎn)失敗的根源在于發(fā)酵物中混入了雜菌。由此人們認(rèn)識(shí)到保持培養(yǎng)物純凈的重要性。

 防止雜菌入侵,獲得純凈的培養(yǎng)物,是研究和應(yīng)用微生物的前提。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物,一方面需要為培養(yǎng)的微生物提供合適的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件,另一方面需要確保無(wú)處不在的其他微生物無(wú)法混入。在本課題中,我們將通過(guò)培養(yǎng)大腸桿菌( Escherichia coil )的實(shí)驗(yàn),學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)的基本技術(shù)。

 基礎(chǔ)知識(shí) (一)培養(yǎng)基 人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求,配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)——培養(yǎng)基(culture media)。其中,配制成的液體狀態(tài)的基質(zhì)稱為液體培養(yǎng)基,配制成的固體狀態(tài)的基質(zhì)稱為固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂后,制成瓊脂固體培養(yǎng)基,它是實(shí)驗(yàn)室中最常用的培養(yǎng)基之一。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng),可以形成肉眼可見(jiàn)的菌落(圖 2-1)。

  雖然各種培養(yǎng)基的具體配方不同,但一般都含有水、碳源(提供碳元素的物質(zhì))、氮源(提供氮元素的物質(zhì))和無(wú)機(jī)鹽;貞浻嘘P(guān)活細(xì)胞中元素組成的知識(shí),想一想為什么大多數(shù)培養(yǎng)基都含有這四類物質(zhì)。下面讓我們一起來(lái)看一看某種細(xì)菌培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成。

 在提供上述幾種主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上,培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì) pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。例如,培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)需要在培養(yǎng)基中添加維生素,培養(yǎng)霉菌時(shí)需將培養(yǎng)基的 pH調(diào)至酸性,培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)需將 pH調(diào)至中性或微堿性,培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)則需要提供無(wú)氧的條件。

 ? 瓊脂(agar)是一種從紅藻中提取的多糖。瓊脂在 98℃以上熔化,在 44℃以下凝固,在常規(guī)培養(yǎng)條件下呈現(xiàn)固態(tài)。

 ? 牛肉膏和蛋白胨來(lái)源于動(dòng)物原料,含有糖、維生素和有機(jī)氮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

 ? 你想知道固體培養(yǎng)基的來(lái)歷嗎?請(qǐng)點(diǎn)擊人教網(wǎng) www.pep.com.cn 查詢。

。ǘo(wú)菌技術(shù) 獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來(lái)雜菌的入侵。無(wú)菌技術(shù)圍繞著如何避免雜菌的污染展開,主要包括以下幾個(gè)方面。

 1.對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手,進(jìn)行清潔和消毒(disinfection)

 。

 2.將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌(sterilization)。

 3.為避免周圍環(huán)境中微生物的污染,實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。

 4.實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

 無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外,還有什么目的? ? 消毒是指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。滅菌則是指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物,包括芽孢和孢子。下面,我們重點(diǎn)學(xué)習(xí)消毒和滅菌的方法。

 實(shí)驗(yàn)室常用的消毒和滅菌方法 在實(shí)驗(yàn)室中,切不可吃東西、喝水,離開實(shí)驗(yàn)室時(shí)一定要洗手,以防止被微生物感染。使用后的培養(yǎng)基丟棄前一定要進(jìn)行滅菌處理,以免污染環(huán)境。

 消毒方法 日常生活中經(jīng)常用到煮沸消毒法。在 100℃煮沸 5~6min 可以殺死微生物細(xì)胞和一部分芽孢。對(duì)于一些不耐高溫的液體,如牛奶,則使用巴氏消毒法,在 70~75℃煮 30min 或在 80℃煮 15 min,可以殺死牛奶中的微生物,并且使牛奶的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞。此外,人們也常使用化學(xué)藥劑進(jìn)行消毒,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等。

 灼燒滅菌 將微生物的接種工具,如接種環(huán)、接種針或其他金屬用具,直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒,可以迅速?gòu)氐椎販缇▓D 2-2)。此外,在接種過(guò)程中,試管口或瓶口等容易被污染的部位,也可以通過(guò)火焰灼燒來(lái)滅菌。

 干熱滅菌

 將滅菌物品放入干熱滅菌箱(圖 2-3)內(nèi),在 160~170℃加熱 1~2 h 可達(dá)到滅菌的目的。能耐高溫的、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)和金屬用具等,可以采用這種方法滅菌。干熱滅菌的具體操作步驟參見(jiàn)附錄 4。

 高壓蒸汽滅菌

 將滅菌物品放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋(圖 2-4 )內(nèi)。把鍋內(nèi)的水加熱煮沸,將其中原有的冷空氣徹底排除后,將鍋密閉,繼續(xù)加熱使鍋內(nèi)的氣壓逐步上升,溫度也隨之升到 l00℃以上。為達(dá)到良好的滅菌效果,一般在壓力為 100 kPa,溫度為 121℃的條件下,維持 15~30min。高壓蒸汽滅菌的具體操作步驟參見(jiàn)附錄 4。

 除了以上方法外,實(shí)驗(yàn)室里還用紫外線或化學(xué)藥物進(jìn)行消毒。例如,接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)在使用前,可以用紫外線照射 30 min,以殺死物體表面或空氣中的微生物。在照射前,適量噴灑石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液,可以加強(qiáng)消毒效果。實(shí)驗(yàn)室中常用的其他化學(xué)消毒劑,參見(jiàn)附錄 5。

 清你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要,請(qǐng)選擇合適的方法。

 1.培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿。

 2.玻棒、試管、燒瓶和吸管。

 3.實(shí)驗(yàn)操作者的雙手。

 實(shí)驗(yàn)操作 ? 教學(xué)用的大楊桿菌可以到國(guó)家指定的菌種保藏中心購(gòu)買。

 本實(shí)驗(yàn)用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基進(jìn)行大腸桿菌的純化培養(yǎng),可分成制備培養(yǎng)基和純化大腸桿菌兩個(gè)階段進(jìn)行。

。ㄒ唬┲苽渑H飧嗟鞍纂斯腆w培養(yǎng)基 1. 計(jì)算

 根據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方的比例,計(jì)算配制 100mL 的培養(yǎng)基時(shí),各種成分的用量。

 ? 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方 牛肉膏

  5.0g 蛋白胨

  10.0g NaCl

 5 .0g 瓊脂

 20 .0g 將上述物質(zhì)溶解后,用蒸餾水定容至 1 000 mL。

 2. 稱量

 準(zhǔn)確地稱取各種成分。牛肉膏比較粘稠,可以用玻棒挑取,放在稱量紙上稱量。牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮,稱取時(shí)動(dòng)作要迅速,稱后要及時(shí)蓋上瓶蓋。

 3. 溶化

 將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯,加入少量的水,加熱。當(dāng)牛肉膏溶化并與稱量紙分離后,用玻棒取出稱量紙。往燒杯中加入稱量好的蛋白胨和氯化鈉,用玻棒攪拌,使其溶解。加入瓊脂,加熱使其熔化。在此過(guò)程中,不斷用玻棒攪拌,防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。當(dāng)瓊脂完全熔化后,補(bǔ)加蒸餾水至 100mL 。

 4. 滅菌

 將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中,加棉塞,包上牛皮紙,并用皮筋勒緊,再放入高壓滅菌鍋,在壓力為 100kPa、溫度為 121℃條件下,滅菌 15~30min。將培養(yǎng)皿用幾層舊報(bào)紙包緊,5~8套培養(yǎng)皿作一包,包好后放入干熱滅菌箱內(nèi),在 160~170℃下滅菌 2 h。

 5. 倒平板

 待培養(yǎng)基冷卻至 50℃左右時(shí),在酒精燈火焰附近倒平板。倒平板的具體操作描述如下。

 倒平板操作 1.將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上,右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶,左手拔出棉塞。

 2.右手拿錐形瓶,使瓶口迅速通過(guò)火焰。

 3.用左于將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙,右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約 10~20mL)倒入培養(yǎng)皿,左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。

 4.等待平板冷卻凝固(大約需 5~10min)后,將平板倒過(guò)來(lái)放置,使皿蓋在下、皿底在上。

 討論 1.培養(yǎng)基滅菌后,需要冷卻到 50℃左右時(shí),才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度? 2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰? 3.平板冷凝后,為什么要將平板倒置? 4.在倒平板的過(guò)程中,如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位,這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎?為什么? (二)純化大腸桿菌 微生物接種的方法很多,最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。請(qǐng)你選用其中的一種方法,在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上純化大腸桿菌。

 ? 微生物的接種技術(shù)還包括斜面接種、穿刺接種等方法。雖然這些技術(shù)的操作方法各不相同,但是,其核心都是要防止雜菌的污染,保證培養(yǎng)物的純度。

 平板劃線法是通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng),可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體,這就是菌落(colony)。

 1.將接種環(huán)放在火焰上灼燒,直到接種環(huán)燒紅。

 2.在火焰旁冷卻接種環(huán),并打開盛有菌液的試管的棉塞。

 3.將試管口通過(guò)火焰。

 4.將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中,沾取一環(huán)菌液。

 5.將試管口通過(guò)火焰,并塞上棉塞。

 6.左手將皿蓋打開一條縫隙,右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi),劃三至五條平行線,蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。

 7.灼燒接種環(huán),待其冷卻后,從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作,在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。

 討論 1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)?在劃線操作結(jié)束時(shí),仍然需要灼燒接種環(huán)嗎?為什么? 2.在灼燒接種環(huán)之后,為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線? 3.在做第二次以及其后的劃線操作時(shí),為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線? 稀釋涂布平板法則是將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋,然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面,進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里,聚集在一起的微生物將被分散成單個(gè)細(xì)胞,從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落。

 系列稀釋操作

 1.將分別盛有 9mL水的 6 支試管滅菌,并按 10 1 ~10 6 的順序編號(hào)。

 2.用移液管吸取 1 mL 培養(yǎng)的菌液,注入 10 1 倍稀釋的試管中。用手指輕壓移液管上的橡皮頭,吹吸三次,使菌液與水充分混勻。

 3.從 10 1 倍稀釋的試管中吸取 1 mL 稀釋液,注入 10 2 倍稀釋的試管中,重復(fù)第 2 步的混勻操作。依次類推,直到完成最后一支試管的稀釋。

 注意:移液管需要經(jīng)過(guò)滅菌。操作時(shí),試管口和移液管應(yīng)在離火焰 1~2cm處。

 涂布平板操作

 l.將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。

 2.取少量菌液(不超過(guò) 0.1mL),滴加到培養(yǎng)基表面。

 3.將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃,待酒精燃盡后,冷卻 8~10s。

 4.用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿,使菌液分布均勻。

 注意:1.將涂布器末端浸在盛有體積分?jǐn)?shù)為 70%的酒精的燒杯中。取出時(shí),要讓多余的酒精在燒杯中滴盡,然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。

 2.操作中一定要注意防火!不要將過(guò)熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中,以免引燃其中的酒精。

 討論 涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無(wú)菌操作要求,想一想,第 2步應(yīng)如何進(jìn)行無(wú)菌操作? 將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基都放入 37℃恒溫箱中,培養(yǎng) 12h 和 24 h 后,分別觀察并記錄結(jié)果。

 結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長(zhǎng)?如果有菌落生長(zhǎng),說(shuō)明了什么? 2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上,你是否觀察到了獨(dú)立的菌落?這些菌落的顏色、形狀和大小相似嗎? 3.培養(yǎng) 12 h和 24 h 后,觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同嗎?如果不同,請(qǐng)分析產(chǎn)生差異的原因。

 4.如果你在培養(yǎng)基上觀察到了不同形態(tài)的菌落,你能分析出可能是由哪些原因引起的嗎? 5.你是如何記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果的?與其他同學(xué)交流互評(píng)。

 課題延伸 為了保持菌種的純凈,需要進(jìn)行菌種的保藏。對(duì)于頻繁使用的菌種,我們可以采用臨時(shí)保藏的方法。首先,將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上,在合適的溫度下培養(yǎng)。當(dāng)菌落長(zhǎng)成后,將試管放入 4℃的冰箱中保藏(圖 2-5)。以后每 3~6 個(gè)月,都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。但是,這種方法保存的時(shí)間不長(zhǎng),菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。

 對(duì)于需要長(zhǎng)期保存的菌種,可以采用甘油管藏的方法。在 3mL 的甘油瓶中,裝人 1 mL 甘油后滅菌。將 1 mL 培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中,與甘油充分混勻后,放在-20℃的冷凍箱中保存。

 練習(xí) 習(xí) 1.請(qǐng)你想一想,日常生活中保存食品的方法有哪些?這些方法是如何阻止或抑制微生物生長(zhǎng)的?

 2.無(wú)土栽培技術(shù)是用人工配制成的培養(yǎng)液來(lái)栽培植物;植物組織培養(yǎng)技術(shù)則是將植物體的組織接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng);而在本課題中,我們著重學(xué)習(xí)了微生物的培養(yǎng)技術(shù)。請(qǐng)你比較這三種培養(yǎng)技術(shù)在設(shè)計(jì)思路和具體操作上的異同。

 3.巴斯德設(shè)計(jì)的鵝頸瓶實(shí)驗(yàn)有力地駁斥了“自然發(fā)生論”,證明微生物只能由微生物產(chǎn)生,不能從沒(méi)有生命的物質(zhì)自然產(chǎn)生。請(qǐng)你解釋其實(shí)驗(yàn)原理,并分析這個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)于微生物學(xué)的進(jìn)步、微生物學(xué)的研究方法以及食品保存等方面所產(chǎn)生的影響。

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