常用藥材中去甲烏藥堿的LC—MS/MS測定方法研究
發(fā)布時(shí)間:2019-08-30 來源: 散文精選 點(diǎn)擊:
摘要:該文建立常用藥材中去甲烏藥堿的LC-MS/Ms測定方法。采用Hypersil Gold-C18柱(100mmx2.1mm,3μm)為色譜柱,流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為甲醇,進(jìn)行梯度洗脫,流量為0.3mL/min;質(zhì)譜采用電噴霧電離(ESI+)模式離子化,選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)掃描。結(jié)果表明:去甲烏藥堿在3.05~122ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(y=1 530.85x-153.164,r=0.9993);檢測限和定量限分別為0.6,3ng/mL;重復(fù)性精密度和中間精密度分別為4.08%和4.73%;平均加樣回收率為86.98%;22種常用中藥材中僅有4種藥材檢測出去甲烏藥堿,含量(μg/g)分別為細(xì)辛(8.66)>黃柏(8.216)>花椒(5.010)>地膚子(4.66)。所建分析方法可快速、靈敏、準(zhǔn)確地定量中藥材中去甲烏藥堿,并提示部分中藥材和食材中存在去甲烏藥堿,運(yùn)動員應(yīng)慎用。
關(guān)鍵詞:去甲烏藥堿;Lc-MS/MS;中藥材;興奮劑
0引言
去甲烏藥堿(higenamine,HG)屬于芐基異喹啉類生物堿,是存在于烏頭、附子、蓮子心等中藥材中的強(qiáng)心活性成分。HG能夠刺激B受體,通過減少血小板黏附、抑制iNOS和上調(diào)HO-1的表達(dá),對心血管產(chǎn)生正力、正時(shí)性作用,增加心輸出量和心率,降血壓;因此,臨床上常被用作強(qiáng)心藥。由于近年在運(yùn)動場上偶有HG陽性發(fā)現(xiàn),為確保運(yùn)動員健康,世界反興奮劑機(jī)構(gòu)(world anti-doping agency,WADA)在《2017年禁用清單國際標(biāo)準(zhǔn)》中將HG明確列為β2:激動劑類禁用物質(zhì)。然而,HG廣泛分布于植物甚至是一些食材中,如減肥產(chǎn)品、能量飲料或運(yùn)動機(jī)能的產(chǎn)品添加劑中常發(fā)現(xiàn)有HG的存在嗍,成為運(yùn)動員誤服HG的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此,必須提前避免運(yùn)動員食用含HG的植物藥材或食材。
關(guān)于HG的檢測文獻(xiàn)較少.常用的檢測方法有HPLC-UV、法、HPLC-FLD法、HPLC-MS法等。其中常規(guī)的HPLC-UV法靈敏度偏低;柱前衍生熒光法,改善了靈敏度,但增加誤差步驟:而采用LC-MS法具有靈敏度高、步驟少、選擇性高等特點(diǎn),目前已有用于體內(nèi)HG的檢測。為此,本文擬采用LC-MS/Ms聯(lián)用技術(shù),在選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式下,首次對常用中藥材和食材中的HG進(jìn)行定性和定量檢測。研究運(yùn)動員常用藥材或食材中HG的分布規(guī)律,篩選出適合運(yùn)動員使用的藥材和食材,補(bǔ)充反興奮劑領(lǐng)域的研究缺陷。
1實(shí)驗(yàn)部分
1.1儀器
Ultimate3000 UHPLC高效液相色譜儀(Dionex)-TSQ Quantum Ultra電噴霧三重四級桿質(zhì)譜儀(Thermo Scientific);Thcrlno Scientific Hypersil GoldC18色譜柱(100mmx2.1 mm,3μm);XS205電子分析天平(Mettler Tdedo公司,感量0.01 mg);KQ-500B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);5430離心機(jī)(德國Eppendorf公司);200 μL、1000μL移液槍(德國Eppendoff公司);超純水制備儀(美國Milli-Q公司)。
1.2試劑與試藥
去甲烏藥堿對照品(98.4%,LC-MS專用,美國Cato Research Chemicals公司);藥材黃柏、花椒、細(xì)辛、地膚子、續(xù)斷、延胡索、紅花、血蝎、赤芍、芙蓉葉、木香、丁香、肉桂、川芎、獨(dú)活、當(dāng)歸、羌活、大黃、川木香、沒藥、大血藤、白芷共22味藥材,購于中藥市場;甲酸(98%,LC-MS專用,百靈威科技有效公司);甲醇(HPLC grade,F(xiàn)isher Scientific)。
1.3對照品溶液的配制
準(zhǔn)確稱取去甲烏藥堿對照品適量于10 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,于4℃下冷藏備用。
1.4供試品溶液的制備
本文以去甲烏藥堿含量較高的細(xì)辛藥材為目標(biāo),設(shè)計(jì)了甲醇濃度、提取時(shí)間、浸泡時(shí)間、藥材粒度等對提取率的考察,最終確定藥材的提取條件為:藥材粉末(40目)約1.0g,精密稱定,于錐形瓶中加入75%甲醇50mL,浸泡1h并超聲提取0.5 h,離心15min(5000r/min),取上清液1mL于10mL量瓶中,加75%甲醇溶液至刻度,搖勻,取溶液適量用0.22μm的微孔濾膜過濾,濾液作為供試品溶液用于LC-MS/MS進(jìn)樣。
1.5儀器條件
1)色譜柱:Thermo Hypersil Gold(100mmx2.1mm,3μm);流動相:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為甲醇,梯度洗脫流程見表1:流量:0.3mL/min;柱溫:35℃:進(jìn)樣體積:5μL。
2)質(zhì)譜條件
電噴霧電離源(ESI);正離子掃描;選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)掃描模式;噴霧電壓3 500kV;毛細(xì)管溫度為350℃;氮?dú)庾鳛榍蕷夂洼o助氣,其中鞘氣壓力為35psi(1psi=6.895kPa),輔助氣壓力為10psi;氬氣為碰撞氣,碰撞壓力為1.5retort(1Ton=133.322Pa);母離子為m/z=272.2,定量離子為m/z=107.3,對應(yīng)的碰撞能量為28eV。
在上述條件下,對照品以及樣品的總離子流圖分別見圖1和圖2,去甲烏藥堿保留時(shí)間約為5.56min,其質(zhì)譜圖見圖3。
1.6基質(zhì)考察
取甲醇10mL,超聲處理1 h,于5000r/min下離心15min,取上清液1mL于10mL容量瓶中,用50%甲醇定容,取適量用0.22μm的微孔濾膜過濾,用于LC-MS/MS進(jìn)樣,結(jié)果說明空白基質(zhì)對去甲烏藥堿的測定無干擾。
2方法學(xué)驗(yàn)證
2.1線性與檢測限
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