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以核基因ITS2片段為DNA條形碼鑒定中藥材威靈仙的研究分析

發(fā)布時(shí)間:2019-08-28 來源: 散文精選 點(diǎn)擊:


  【摘要】 目的:探討以核基因ITS2片段為DNA條形碼鑒定中藥材威靈仙的效果,從而為臨床用藥提供依據(jù)。方法:選取18份威靈仙藥材樣品以及混偽品作為研究對(duì)象,提取威靈仙的DNA,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增其ITS2序列,雙向測(cè)序,所得的序列經(jīng)過CodonCode Aligner進(jìn)行拼接,采用HMMer注釋法對(duì)網(wǎng)上數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,并構(gòu)建NJ(鄰接)樹。結(jié)果:威靈仙藥材的三個(gè)基源植物為毛茛科威靈仙、東北鐵線蓮、棉團(tuán)鐵線蓮,其序列長(zhǎng)度分別為230 bp、230 bp、220 bp;威靈仙藥材正品來源的三種植物聚集為一枝,其支持率為83%;威靈仙與混偽品在二級(jí)結(jié)構(gòu)上具有明顯的差異。結(jié)論:核基因ITS2片段作為DNA條形碼能夠穩(wěn)定以及準(zhǔn)確的鑒別中藥材威靈仙以及混偽藥品,從而為保障臨床安全用藥提供一種新的技術(shù)手段,具有廣闊的應(yīng)用前景。
  【關(guān)鍵詞】 ITS2片段; DNA條形碼; 中藥材; 威靈仙
  中圖分類號(hào) R28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805(2014)8-0155-02
  威靈仙屬于藥用植物,藥材基源以及來源比較多,在我國(guó)內(nèi)分布較廣泛,其根莖入藥具有通經(jīng)絡(luò)、風(fēng)濕以及消骨哽的功效,在膽結(jié)石、足跟痛以及食管癌等治療上起著重要作用[1]。作為常用中藥,地區(qū)用藥習(xí)慣的差異性較大,導(dǎo)致威靈仙使用混亂現(xiàn)象比較嚴(yán)重,因此有必要對(duì)威靈仙以及混偽品進(jìn)行鑒別研究。近年來,DNA條形碼技術(shù)因其具有較強(qiáng)的通用性以及鑒定結(jié)果可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn),因而被廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定中。本文就運(yùn)用核基因ITS2片段來鑒定中藥材威靈仙以及混偽品,從而為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù),現(xiàn)報(bào)告如下。
  1 資料與方法
  1.1 一般資料
  本文選取的18份威靈仙樣品均來自Genbank下載序列,主要有棉團(tuán)鐵線蓮、東北鐵線蓮、毛蕊鐵線蓮、須蕊鐵線蓮、柱果鐵線蓮、草珊瑚、桃兒七、芍藥以及土茯苓。此樣品均經(jīng)過余霖副研究員鑒定,同時(shí)此標(biāo)本均在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本館得以保存。
  1.2 鑒定方法
  1.2.1 DNA提取 植物DNA提取試劑盒則來自北京天根生物技術(shù)有限公司;2×Tag PCR Master Mix采用北京艾德生物科技公司。采用70%的乙醇擦洗藥材樣品表面,擦洗完成之后進(jìn)行研磨;進(jìn)而取出16 mg的樣品;采用硅膠對(duì)植物葉進(jìn)行干燥,取30 mg樣品;最后采用提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取。
  1.2.2 PCR擴(kuò)增以及側(cè)序 引物均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增引物正向?yàn)?’-GCGATACTTGGTGTGAAT-3’,反向?yàn)?’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,40轉(zhuǎn);72 ℃10 min。PCR體系含有25 mm的MgCl2 2 μl,2.5 mm的dNTP 2 μl,PCR bufer 2.5 μl(10×)。引物為1.0 μl(2.5 μm),聚合酶為1.0 U,DNA總共為1 μl,反應(yīng)體積為25 μl。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化之后,采用ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序[2-3]。
  1.3 數(shù)據(jù)處理分析
  所有序列采用CodonCode Aligner V2.06校對(duì)拼接,去除引物區(qū)。對(duì)于網(wǎng)上所獲取的ITS序列,均采用HMMer注釋法進(jìn)行分析進(jìn)而獲得ITS2間隔序列。然后,將所有序列采用軟件MEGA5.0進(jìn)行分析對(duì)比。采用NJ鄰接法對(duì)利用對(duì)比過的序列構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹,對(duì)各種物種進(jìn)行鑒定。最后,根據(jù)ITS2數(shù)據(jù)庫以及網(wǎng)站對(duì)ITS2的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。
  2 結(jié)果
  2.1 序列比較
  威靈仙藥材的三個(gè)基源植物分別為毛茛科威靈仙(clematis chinensis osbeck)、東北鐵線蓮(clematis manshurica rup)、棉團(tuán)鐵線蓮(clematis hexapetala pall)。其序列長(zhǎng)度分別為230 、230、220 bp。威靈仙與東北線鐵鏈、棉團(tuán)鐵線蓮之間的距離分別為0.017、0.006。由此看出,威靈仙與三個(gè)藥品源的遺傳距離最小,并且差異最小。草珊瑚與棉團(tuán)鐵鏈、東北線鐵線蓮之間的遺傳距離分別為1.077、1.146,得出其他藥品之間的遺傳距離相對(duì)較大。
  2.2 聚類分析
  通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹,看出威靈仙不同來源樣品為一枝,呈現(xiàn)明顯的單系性,其支持率為83%。
  2.3 威靈仙以及混偽品ITS2的序列二級(jí)結(jié)構(gòu)
  威靈仙與三個(gè)混偽品在二級(jí)結(jié)構(gòu)上具有明顯的差異,主要表現(xiàn)在莖環(huán)(loop)的大小、樹木以及位置上,不同物種之間或多或少都存在一定的區(qū)別。
  3 討論
  威靈仙(radix clematidis)為雙葉子植物毛茛科植物威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮(山蓼)或者東北鐵線蓮(黑薇)的干燥根以及根莖[4]。具有通經(jīng)止痛的效果,在臨床用藥中得到廣泛應(yīng)用。然而,由于地方用藥之間存在一定的差異,使得威靈仙用藥混亂現(xiàn)象較為嚴(yán)重。如南方則以毛茛科鐵線蓮屬Clematis植物作為威靈仙的入藥,北方則以百合科菝葜屬Smildx植物作為威靈仙入藥。同時(shí)由于沒有專業(yè)以及統(tǒng)一的鑒定人員對(duì)威靈仙藥材進(jìn)行鑒定,使得使用者使用該藥物之后,中毒現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生,對(duì)人體身體健康帶來嚴(yán)重影響[5]。鑒于此種情況,需要一種簡(jiǎn)單并且迅速的方法來對(duì)威靈仙藥材以及偽劣品進(jìn)行鑒別。
  傳統(tǒng)的中藥材鑒定方法如化學(xué)指紋圖譜等鑒定方法、顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)、以及超微結(jié)構(gòu)方法等,在中藥材鑒定以及評(píng)價(jià)質(zhì)量上起著重要作用[6]。然而,由于中藥飲片、中藥粉末以及含有生藥原型的傳統(tǒng)中成藥的鑒定較為困難,這些方法已經(jīng)不能精確對(duì)其地進(jìn)行鑒定。準(zhǔn)確的物種鑒定是人類認(rèn)知生物多樣性的前提條件,在此種環(huán)境下,DNA條形碼應(yīng)運(yùn)而生。DNA條形碼主要是利用基因組中相對(duì)較短的DNA片段進(jìn)行藥材物種進(jìn)行鑒別的手段。通過此種方法能建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫以及鑒定平臺(tái),實(shí)現(xiàn)藥材正品與偽劣品的鑒別。另一方面,ITS2序列的長(zhǎng)度較短,容易擴(kuò)增,同時(shí)作為ITS的一部分,在系統(tǒng)化研究中得到廣泛應(yīng)用,同時(shí)也是藥用植物DNA條形碼鑒定中最優(yōu)的序列。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有學(xué)者對(duì)其序列組合進(jìn)行研究[7-9],同時(shí)提出了不同的序列組合來作為植物鑒定的條形碼。據(jù)文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道,其鑒定物種水平的能力達(dá)到93.1%,優(yōu)于國(guó)際條形碼協(xié)會(huì)提出的組合標(biāo)準(zhǔn)。在本次研究中,通過ITS2片段能夠鑒定出威靈仙與混劣品之間的差異。

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