單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌液相芯片檢測(cè)方法的建立
發(fā)布時(shí)間:2018-06-24 來源: 人生感悟 點(diǎn)擊:
摘 要:目的是建立一種快速檢測(cè)單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌的液相芯片檢測(cè)方法。采用基于間接競(jìng)爭(zhēng)法的原理,將3種細(xì)菌抗原分別與不同的聚苯乙烯微球偶聯(lián),以藻紅蛋白(PE)熒光標(biāo)記二抗為信號(hào),優(yōu)化反應(yīng)條件,對(duì)建立的方法進(jìn)行靈敏度、特異性和可重復(fù)性驗(yàn)證。結(jié)果顯示,3種細(xì)菌檢測(cè)抗體最佳加入量分別為10ng、10ng、5ng,建立的方法檢測(cè)單增李斯特菌、副溶血弧菌和沙門氏菌的最低檢測(cè)限均可達(dá)到103 CFU/mL,檢測(cè)其他常見食源性致病菌無交叉反應(yīng)。結(jié)論表明,建立了一種快速檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌的液相芯片檢測(cè)方法,能夠應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。
關(guān)鍵詞:?jiǎn)卧隼钏固鼐?副溶血弧菌 沙門氏菌 液相芯片 檢測(cè)
前言
近年來,食源性疾病已成為世界上最突出、最廣泛的食品安全問題,病原微生物引起的食源性疾病則是影響食品安全的最主要因素之一[ 1 ]。微生物性食物中毒事件主要由食物污染或變質(zhì)、生熟交叉污染等原因引起,且氣溫較高、氣候潮濕的環(huán)境適于細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖,導(dǎo)致食物易于腐敗變質(zhì),一旦儲(chǔ)存、加工不當(dāng),極易發(fā)生由沙門氏菌、副溶血性弧菌等微生物引起的食物中毒,F(xiàn)行檢測(cè)手段已無法滿足日常對(duì)食源性致病菌檢測(cè)的需要,目前檢驗(yàn)檢疫工作中常用于檢測(cè)和鑒定食源性致病菌的方法主要有PCR、Southem Blot雜交、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等一些簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法[ 2 ],F(xiàn)行的檢測(cè)方法一般以檢測(cè)致病菌為主,需要增菌培養(yǎng),檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),無法滿足高通量的檢測(cè)要求,遠(yuǎn)不能滿足食品檢測(cè)的需要,市場(chǎng)迫切需要能同時(shí)檢測(cè)食源性致病菌的靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、簡(jiǎn)便快捷的高通量技術(shù)和方法[ 3 ]。因此,目前迫切需要發(fā)展一種快速、準(zhǔn)確的方法來檢測(cè)和追蹤病原體和污染物的來源[4]。
液相芯片技術(shù)是在流式細(xì)胞技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和傳統(tǒng)芯片技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)的新一代生物芯片技術(shù)和新型蛋白質(zhì)研究平臺(tái),能同時(shí)檢測(cè)多種致病菌。邱楊等[ 5 ]通過該法建立了對(duì)沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌的快速液相芯片檢測(cè)方法,檢測(cè)靈敏度達(dá)到50~100copies/mL。郭啟新等[ 6 ]建立了對(duì)金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、志賀氏菌的檢測(cè)方法,具有很好的特異性,檢測(cè)靈敏度分別達(dá)38、44、21CFU/mL。Sun等[ 7 ]利用該法建立了高通量的同時(shí)檢測(cè)6種食源性致病菌的方法,檢測(cè)靈敏度達(dá)到20.4×103CFU/mL,遠(yuǎn)高于PCR。
但基于多重PCR的液相芯片技術(shù)對(duì)單管樣本進(jìn)行大量不同指標(biāo)的高通量多重PCR方法建立仍存在困難,至今鮮見液相芯片用于檢測(cè)多種致病菌方法建立的相關(guān)報(bào)道。將液相芯片技術(shù)應(yīng)用到食源性致病菌檢測(cè)中,可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行多種致病菌靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè),因而有望大大提高食源性致病菌的檢測(cè)效率,在有效控制食物中毒事件的發(fā)生、食品安全控制、海關(guān)進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫、臨床診斷等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
1 材料與方法
1.1 材料
Luminex 200液相懸浮芯片系統(tǒng)(美國(guó)Luminex公司);4625型孔板振蕩器;ST16R冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);編號(hào)No.18、No.29、No.52的微球(美國(guó)Luminex公司);罨彌_液:0.1mol/L NaH2P04- N a2 HP04,pH6.2;磷酸鹽緩沖液(PBS):138mmol/L NaCI,2.7mmol/L KCl,8mmol/ L Na2HP04,1.5mmol/L KH2P04,pH7.4;洗滌緩沖液:PBS,0.05%Tween-20,pH7.4;分析緩沖液:PBS,1%BSA,pH7.4;封閉緩沖液:50mmol/L Tris,153mmol/L NaCl,2%BSA,0.05%Tween-20,pH7.4;儲(chǔ)存緩沖液:PBS,0.1%BSA,0.02%Tween-20,0.05%疊氮化鈉,pH7.4。菌種為本實(shí)驗(yàn)室保藏與西北農(nóng)林科技大學(xué)食品實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。
1.2 方法
1.2.1 微球偶聯(lián)抗原
、偃∥⑶50μL(1.25×106個(gè)/mL)置于EP管,14000g離心4min,棄上清液。
、诩尤40μL活化緩沖液重懸微球,漩渦混合30s。
、奂尤50mg/mL NHS和EDC各5μL,混勻,避光室溫下旋轉(zhuǎn)混合600rpm,20min。
、芗尤150μL PBS,漩渦混合10s,14000g離心4min,棄上清液。
、萦肞BS洗滌3次后,加入150μL PBS重懸,再加入抗原,用PBS補(bǔ)齊至500μL,避光室溫旋轉(zhuǎn)混合600rpm,2h。
⑥14000g離心4min,棄上清液。
⑦加入150μL封閉緩沖液,漩渦混合15s,避光室溫旋轉(zhuǎn)混合600rpm,30min。
⑧16000g離心4min,棄上清液,加入100μL儲(chǔ)存緩沖液4℃保存偶聯(lián)的微球?乖尤肓繛50ng。1.2.2 檢測(cè)
、偃〕雠悸(lián)微球,恢復(fù)至室溫后漩渦30s。
、96孔板中加入100μL PBS預(yù)濕實(shí)驗(yàn)孔,抽去孔內(nèi)液體,每孔中加入適量預(yù)混好的偶聯(lián)微球(約2000個(gè)),用150μL PBS洗滌兩次。
、蹖⑦m量標(biāo)準(zhǔn)品或樣品分別加入合適的孔中,空白孔加入等量PBS,再加入適量的抗體,用PBS補(bǔ)齊各孔至100μL。
、苡靡埔浩鞣磸(fù)抽吸混勻孔內(nèi)溶液,避光條件下37℃,600rpm振蕩60min。
、莘磻(yīng)完畢后,抽去孔內(nèi)液體,用150μL PBS洗滌兩次。
、廾靠字屑尤100μL經(jīng)適當(dāng)稀釋的PE標(biāo)記二抗,移液器反復(fù)抽吸混勻。
、弑芄鈼l件下,37℃,600rpm振蕩45min后,抽去孔內(nèi)液體,用150μL PBS洗滌兩次。
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