摘要：為降低上部煙葉中淀粉和蛋白質(zhì)等大分子成分含量，提高其吸食品質(zhì)，本研究在統(tǒng)一評(píng)價(jià)酶活力的基礎(chǔ)上，選用4種酶制劑（淀粉酶IV.蛋白酶I、果膠酶I和纖維索酶II）配制復(fù)合酶制劑，采用單因素法和Box-Benhnken響應(yīng)面分析法對(duì)影響酶解效果的復(fù)合酶量、緩沖液pH、含水量和酶解時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化。分析顯示，4個(gè)因素對(duì)上部煙葉中淀粉和蛋白質(zhì)降解率的影響順序?yàn)椋壕彌_液pH>酶解時(shí)間>含水量>復(fù)合酶量。響應(yīng)面分析結(jié)果確定最優(yōu)酶解條件為：復(fù)合酶量1.1單位（即淀粉酶Ⅳ33U/g煙葉，蛋白酶I 550U/g煙葉，果膠酶1220U/g煙葉，纖維索酶II220U/g煙葉）、緩沖液pH 7.7、含水量54%、酶解時(shí)間5.5 h，此時(shí)淀粉和蛋白質(zhì)降解率分別為19.54%和20.03%。本研究中的復(fù)合酶制劑及酶解條件可以很好地結(jié)合于煙草打葉復(fù)烤工藝過程中，具有較好的應(yīng)用前景。
　　關(guān)鍵詞：復(fù)合酶：上部煙葉：淀粉：蛋白質(zhì)：響應(yīng)面法
　　烤煙的上部煙葉包括上二棚葉和頂葉，共6～7片，占整株煙葉總產(chǎn)量的30%-40%。上部煙葉葉片較厚，組織結(jié)構(gòu)較緊密，淀粉、蛋白質(zhì)等大分子成分含量過高，燃燒后具有煙氣濃度和勁頭大、刺激性大、雜氣重等缺點(diǎn)，工業(yè)可用性較差。
　　近年來(lái)的研究中，改善上部煙葉吸食品質(zhì)的方法主要有3種：生物酶法、化學(xué)添加法、微生物發(fā)酵法。其中，生物酶法因?yàn)闂l件溫和、易于操作、改善效果明顯，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定優(yōu)勢(shì)。外加復(fù)合酶在較溫和的條件下，將淀粉、蛋白質(zhì)以及果膠、纖維素（細(xì)胞壁物質(zhì)）等大分子物質(zhì)分解成低聚糖、半乳糖醛酸、還原糖、短肽和氨基酸等以減少煙草原料的刺激性和雜氣，改善吸食品質(zhì)，提高其在煙草行業(yè)中的使用價(jià)值。然而，由于不同來(lái)源的市售酶制劑酶活單位定義不同，無(wú)法比較不同來(lái)源酶制劑的作用效果，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)得出的酶制劑使用量和配方無(wú)法重現(xiàn)。因此，雖然已有較多酶法改善上部煙葉品質(zhì)的研究，但實(shí)際應(yīng)用較少。
　　本研究選擇4類生物酶（淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和纖維素酶），在對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)一酶活評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，以淀粉降解率和蛋白質(zhì)降解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素法和響應(yīng)面法對(duì)復(fù)合酶量、酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，以縮短酶解時(shí)間，與現(xiàn)代煙草加工工藝相協(xié)調(diào)，使上部煙葉中淀粉和蛋白質(zhì)的含量降低，同時(shí)增加水溶性糖分及氨基酸，使上部煙葉中各化學(xué)成分比例相對(duì)協(xié)調(diào)，從而改善上部煙葉的雜氣、勁頭和刺激性，為提高上部煙葉品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。
　　1材料與方法
　　1.1試驗(yàn)材料
　　上部煙葉B2F：上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司提供，2014年產(chǎn)于貴州，煙葉經(jīng)切絲后用于酶解。鹽酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、濃硫酸等，AR：酪蛋白、果膠、淀粉：半乳糖醛酸標(biāo)品。以上試劑均由中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司生產(chǎn)。
　　淀粉酶I，中溫淀粉酶BAN 0.8L（諾維信Novozymes生物技術(shù)有限公司）：淀粉酶II，高溫淀粉酶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）：淀粉酶III，高溫淀粉酶（上海麥克林生化科技有限公司）：淀粉酶IV，低溫淀粉酶（江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司）。蛋白酶I，中性蛋白酶0.8 L（諾維信Novozymes生物技術(shù)有限公司）：蛋白酶II，水解蛋白酶2.4 L（諾維信Novozymes生物技術(shù)有限公司）：蛋白酶III，中性蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）。果膠酶I，上海源葉生物科技有限公司：果膠酶II，江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司。纖維素酶I，上海麥克林生化科技有限公司：纖維素酶II，江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司。
　　1.2儀器與設(shè)備
　　H2-2型電熱恒溫振蕩水浴箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司：TGL-16M型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司：Enspire 2300多標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)（酶標(biāo)儀），美國(guó)PerkinElmer公司UV3000型紫外一可見光分光光度計(jì)，日本Himchi公司：MB45紅外水分測(cè)定儀，美國(guó)OHAUS儀器有限公司：FA1004型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司：SKD-200凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司；SKD-0892紅外智能消化爐，上海沛歐分析儀器有限公司。
　　1.3測(cè)定方法
　　1.3.1原料預(yù)處理
　　陳化后的上部煙葉經(jīng)松散回潮、切絲、烘絲后，制得試驗(yàn)用長(zhǎng)度均勻的煙絲（水分約12.5%，以紅外水分測(cè)定儀測(cè)得）。
　　1.3.2煙絲的酶解精確稱�。�25.00±0.02）g煙絲置于篩網(wǎng)，于65℃水浴箱中保溫回潮20 min，使煙絲水分含量約21%。將回潮結(jié)束的煙絲平鋪于干凈的20 cmx16 cm陶瓷托盤，按照一定料水比將酶液（pH 7.5磷酸緩沖液溶解并稀釋）均勻噴灑在煙絲上，噴灑過程中常翻動(dòng)煙絲使酶液混合均勻，以食品級(jí)密封袋密封好，于適當(dāng)溫度恒溫箱中酶解。酶解結(jié)束后，采用烘箱快速烘干至水分含量12.0%-12.5%，待測(cè)。
　　1.3.3復(fù)合酶制劑配方中酶種類的選擇在30～70℃范圍內(nèi)測(cè)試各種酶的活性變化，初步確定適合于多種酶類進(jìn)行反應(yīng)的溫度，以及在此溫度下活性較高的商品酶（淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和纖維素酶各1種）作為酶制劑的配方用酶，同時(shí)對(duì)酶的活性進(jìn)行統(tǒng)一評(píng)價(jià)。根據(jù)所確定的酶解溫度和酶種類，將1mL一定濃度的淀粉酶、果膠酶、纖維素酶分別與蛋白酶混合，在40℃下反應(yīng)30 min，迅速將混合體系置于冷水中冷卻，再測(cè)定各種酶的活性。以不添加蛋白酶的體系為對(duì)照，確定蛋白酶對(duì)其他酶活性的影響。
　　1.3.4單位復(fù)合酶制劑中各種酶添加量的確定以不同濃度的淀粉酶（2、5、10、30、50 U/g煙葉）、蛋白酶（100、250、500、1000、2000 U/g煙葉）、果膠酶（50、100、200、500、1000 U/g煙葉）、纖維索酶（50、100、150、200、300 U/g煙葉）分別以料水比20：1加料于煙絲，密封后于40℃恒溫酶解30 min，按1.3.2所述烘干至水分含量12.0%-12.5%，測(cè)定各樣品中相應(yīng)成分含量，根據(jù)結(jié)果確定單位復(fù)合酶中各種酶的添加量。

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