[摘要]湖北貝母為傳統(tǒng)中藥，然而《Flora of China》將其基原植物湖北貝母Fritillaria hupehensis歸并于天目貝母F.monantha項下。該實驗采用分子系統(tǒng)學方法，以川百合Lilium davidii為外類群，用核基因ITS序列和葉綠體基因rpl16序列、matK序列等3個片段對湖北貝母及其近緣類群天目貝母F.monantha、安徽貝母F. anhuiensis等進行聯合建樹分析，對湖北貝母植物的系統(tǒng)位置進行了探討，為湖北貝母藥材的安全使用提供分子證據。結果顯示，分子系統(tǒng)樹上，3種貝母各自的居群聚為一支，之后天目貝母與安徽貝母聚為一支，最后與湖北貝母聚為一支。表明湖北貝母與天目貝母的親緣關系可能要遠于安徽貝母與天目貝母之間的關系，因此不適宜將湖北貝母歸并于天目貝母。
　　[關鍵詞]湖北貝母； 天目貝母； 安徽貝母； ITS； rpl16； matK
　　貝母為我國傳統(tǒng)中藥，具有清熱化痰，止咳散結的功效，2010年版《中國藥典》^[1]中記載了5個品種的貝母類藥材，分別是川貝母、浙貝母、湖北貝母、伊貝母和平貝母，涵蓋了貝母屬植物10種1變種。貝母屬植物主要分布于北半球的溫帶地區(qū)，全世界130多種，中國有20多種，除《中國藥典》記載的種類外，在中國民間，其余貝母屬物種也多作為貝母類藥材的代用品使用。然而，由于形態(tài)性狀變異復雜，加之可能存在的種間雜交^[2-3]，使得該屬，特別是東亞地區(qū)物種分類處理并不十分清晰，這直接導致了藥材使用上的不便，如藥材湖北貝母的基原植物湖北貝母Fritillaria hupehensis為《中國藥典》2010年版所收錄，中文版《中國植物志》^[4]也承認該種的成立，然而隨后《中國植物志》的同一作者卻出版了截然不同的意見，陳心啟等^[3]在討論長江中下游地區(qū)的貝母屬分類時，認為湖北貝母的性狀變異幅度在廣義的天目貝母F.monantha性狀變異范圍內，進而在2000年出版的《Flora of China》中將湖北貝母作為天目貝母的異名處理。這一處理是建立在形態(tài)學基礎上的，是否合理應該得到更多其他領域的數據支持，有待進一步深入研究探討。
　　近十幾年來，隨著分子直接測序技術的普及，DNA序列片段已經被廣泛運用于植物系統(tǒng)學的研究。ITS為核核糖體DNA內轉錄間隔區(qū)，具有較快的進化速率，適于用來解決一些較低分類階元的問題，應用最為廣泛。葉綠體基因為單拷貝基因，有利于系統(tǒng)樹的構建。rpl16是cpDNA中進化速率最快的內含子之一，一般用于較低分類階元或近緣類群間^[5]。matK是葉綠體基因組的蛋白編碼區(qū)中進化最快的基因之一，也是近年中分子系統(tǒng)發(fā)育研究中使用頻率最高葉綠體片段之一^[6]。在國外尤其是中東地區(qū)，有關貝母屬分子系統(tǒng)的研究較為深入，但國內這方面的報道還很少見，本實驗根據國外貝母屬分子系統(tǒng)學研究基礎^[7]選擇ITS，rpl16，matK 3個序列片段，對中國貝母屬下的部分植物開展分子系統(tǒng)學研究，焦點集中于與天目貝母和湖北貝母親緣關系較近的幾個物種，以期利用分子證據解決分類系統(tǒng)難題，同時也為貝母類藥材基源的準確分類和應用提供更多的證據。
　　1 材料與方法
　　1.1 樣品采集 用于本實驗中湖北貝母、天目貝母及親緣關系較近的貝母屬植物均采自模式產地的野外或栽培居群，為硅膠干燥的新鮮葉片，可以較好的代表該種貝母植物，來源見表1。植物標本由北京藥用植物研究所張本剛研究員鑒定，憑證標本保存于北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所資源中心。另外伊貝母以及作為外類群分析用的川百合序列來源于GenBank。
　　1.4 PCR擴增與測序 PCR擴增反應在ABI 2720PCR擴增儀上進行。PCR酶采用北京艾德萊生物科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix。
　　PCR擴增反應體系25 μL：12.5 μL Master Mix，引物（ITS 2.5 μmol·L^-1；rpl16，matK 5 μmol·L^-1） 各1，2 μL總DNA樣品，8.5 μL ddH2O。
　　PCR擴增程序為：94 ℃預變性（ITS 3 min；rpl16，matK 5 min）；94 ℃變性1 min，退火1 min（ITS 58 ℃；rpl16 54 ℃；matK 53 ℃ ），72 ℃延伸（ITS，rpl16 2 min；matK 2.5 min）；循環(huán)數（ITS 32；rpl16，matK 35 ）；72 ℃延伸（ ITS 5 min；rpl16，matK 7 min）；4 ℃保存。
　　1.5 序列測定 PCR 產物的純化和序列測定均由中美泰和生物技術（北京）有限公司完成。 PCR 產物直接雙向測序，測序引物為PCR引物。為保證測序順利，部分樣品的matK序列加測了中間引物。
　　1.6 序列分析 所測序列用CodonCode Aligner 3.7.1（Condon Code Co.，Germany）進行校對拼接，然后用MEGA5.2對其與從GenBank中下載的序列進行比對。以川百合為外類群，采用對最大簡約法（maximum parsimony， MP）、最大似然法（maximum likelihood， ML）對3個序列進行聯合構建系統(tǒng)樹：最大簡約樹的構建采用PAUP4.0b10進行，使用啟發(fā)式搜索，TBR分支交換算法；最大似然樹的構建采用MEGA5.2進行，使用T-3-P + G的模型。最大似然使用的模型由MEGA5.2計算所得。用靴帶分析（bootstrap）1 000次重復檢驗分支的可靠性，空缺（gap）始終做缺失（missing）處理。
　　2 結果與分析

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