中藥材川貝母的DNA分子標(biāo)記鑒定研究
發(fā)布時(shí)間:2019-08-28 來源: 感恩親情 點(diǎn)擊:
摘要: 貝母為常用貴重中藥材,藥用歷史悠久,我國(guó)貝母屬植物已超過50種(變種),全國(guó)各地用作貝母的原植物種類繁多,此外商品貝母中還;煊型霖惸浮⑻戚牌训葌纹,嚴(yán)重影響了藥品的安全性和有效性,由于貝母類藥材的形態(tài)學(xué)上的差異較小,但是化學(xué)成分差異大,因此準(zhǔn)確地鑒定貝母類藥材的基源種類是一項(xiàng)極為重要的工作,為了探索貝母類藥材的快速、準(zhǔn)確的鑒別方法,運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定川貝母的真?zhèn),以克服目前僅依據(jù)形態(tài)、顯微特征及理化進(jìn)行鑒別的不足。
關(guān)鍵詞: 川貝母;DNA;PCR 【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1672-8602(2014)03-0196-01
川貝母系百合科植物川貝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫貝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肅貝母Fritillaria przewalskii Maxim.、梭砂貝母Fritillaria delavayi Franch.、太白貝母Fritillaria taipaiensis P.Y.Li或瓦布貝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu.S.Wang et S.C.Chen的干燥鱗莖。按性狀不同分別習(xí)稱"松貝"、"青貝"、"爐貝"和"栽培品"。川貝母性微寒而味甘苦,入心肺經(jīng),能潤(rùn)肺、止咳、化痰,是一味珍貴的中藥材。"中國(guó)藥典"規(guī)定藥用川貝母為以上6個(gè)品種,但我國(guó)貝母屬植物已超過50種,造成貝母基源極為復(fù)雜,并且隨著需求量的增加,基源混亂的現(xiàn)象呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì),直接影響川貝母臨床用藥的安全、療效。運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定川貝母的真?zhèn),以克服目前僅依據(jù)形態(tài)、顯微特征及理化進(jìn)行鑒別的不足。使中藥鑒定的手段從傳統(tǒng)的形態(tài)表征擴(kuò)展到了遺傳物質(zhì)DNA。特別是近年來微量DNA的PCR技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展,使分子生物學(xué)技術(shù)與方法以特異性強(qiáng),穩(wěn)定性好,微量、準(zhǔn)確等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于近緣種、珍稀種、破碎藥材等的鑒定。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)川貝母進(jìn)行了研究,建立了川貝母DNA分子標(biāo)記鑒定方法,為川貝母與其偽品的鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。
1 材料與儀器
1.1 藥材:(1)伊貝母對(duì)照藥材、平貝母對(duì)照藥材、湖北貝母對(duì)照藥材、浙貝母對(duì)照藥材、川貝母對(duì)照藥材(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。(2)青貝、爐貝、濃蜜貝母(廣西錦瑩藥業(yè)有限公司)。
1.2 試藥: 新型植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司);10×PCR緩沖液、二氯化鎂(25mmol/L)、dNTP(10mmol/L)、鑒別引物:5ˊCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA 3ˊ和5ˊGCTACGTTCTTCATCGAT 3ˊ、無菌超純水、瓊脂糖、50×TAE電泳緩沖液、DNA分子量標(biāo)記物GM331(上海生工);GelRed核酸凝膠染色劑(BIOTIUM);高保真Taq DAN聚合酶(5U/μl)、10×酶切緩沖液、Sma I(10U/μl)(Fermentas)。
1.3 儀器:H1850型臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司);K960型熱循環(huán)儀(杭州晶格儀器有限公司);DYCP-31DN型電泳儀(北京六一儀器廠);GSG-2000核酸/蛋白質(zhì)凝膠成像儀(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)。
2 方法
2.1 模板DNA提取:取本品0.1g,依次用75%乙醇1ml、滅菌超純水1ml清洗,吸干表面水分,置乳缽中研磨成極細(xì)粉。取20mg ,置1.5ml離心管中,用新型廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA[加入緩沖液AP1 400μl和RNA酶溶液(10mg/ml)4μl,渦漩振蕩,65℃水浴加熱10分鐘,加入緩沖液AP2 130μl,充分混勻,冰浴冷卻5分鐘,離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘14000轉(zhuǎn))10分鐘;吸取上清液轉(zhuǎn)移入另一離心管中,加入1.5倍體積的緩沖液AP3/E,混勻,加到吸附柱上,離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘13000轉(zhuǎn))1分鐘,棄去過濾液,加入漂洗液700μl,離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn))30秒,棄去過濾液;再加入漂洗液500μl,離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn))30秒,棄去過濾液;再離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘13000轉(zhuǎn))2分鐘,取出吸附柱,放入另一離心管中,加入50μl洗脫緩沖液,室溫放置3~5分鐘,離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn))1分鐘,將洗脫液再加入吸附柱中,室溫放置2分鐘,離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn))1分鐘],取洗脫液,作為供試品溶液,置4℃冰箱中備用。另取川貝母對(duì)照藥材0.1g,同法制成對(duì)照藥材模板DNA溶液。
2.2 PCR-RFLP反應(yīng):鑒別引物:5ˊCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA 3ˊ和5ˊGCTACGTTCTTCATCGAT 3ˊ。PCR反應(yīng)體系:在200μl離心管中進(jìn)行,反應(yīng)總體積為30μl,反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液3μl,二氯化鎂(25mmol/L)2.4μl,dNTP(10mmol/L)0.6μl,鑒別引物(30μmol/L)各0.5μl,高保真Taq DAN聚合酶(5U/μl)0.2μl,模板1μl,無菌超純水21.8μl。將離心管置PCR儀,PCR反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性4分鐘,循環(huán)反應(yīng)30次(95℃ 30秒,55~58℃ 30秒,72℃ 30秒),72℃延伸5分鐘。取PCR反應(yīng)液,置500μl離心管中,進(jìn)行酶切反應(yīng),反應(yīng)總體積為20μl,反應(yīng)體系包括10×酶切緩沖液2μl,PCR反應(yīng)液6μl,Sma I(10U/μl)0.5μl,無菌超純水11.5μl,酶切反應(yīng)在30℃水浴反應(yīng)2小時(shí)。另取無菌超純水,同法上述PCR-RFLP反應(yīng)操作,作為空白對(duì)照。
2.3 電泳檢測(cè): 膠濃度為1.5%,膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed;供試品與對(duì)照藥材酶切反應(yīng)溶液的上樣量分別為8μl,DNA分子量標(biāo)記上樣量為1μl(0.5μg/μl)。電泳結(jié)束后,取凝膠片在凝膠成像儀上檢視。
3 結(jié)果
注:1伊貝母對(duì)照藥材、2平貝母對(duì)照藥材、3湖北貝母對(duì)照藥材、4浙貝母對(duì)照藥材、5川貝母對(duì)照藥材、6青貝、7爐貝、8濃蜜貝母、9空白、M分子量標(biāo)記物(100~600bp)。經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后,青貝、爐貝與川貝母對(duì)照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上,在100~250bp有兩條DNA條帶。伊貝母對(duì)照藥材、平貝母對(duì)照藥材、湖北貝母對(duì)照藥材、浙貝母對(duì)照藥材、濃蜜貝母與川貝母對(duì)照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上,在100~250bp無DNA條帶。
4 討論
由于本實(shí)驗(yàn)采用DNA吸附柱和新型獨(dú)特的溶液系統(tǒng),適合于從含酚類、多糖類和酶抑制物的制物樣品中快速簡(jiǎn)單地提取基因組DNA。在此基礎(chǔ)上采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)對(duì)伊貝母、平貝母、湖北貝母、浙貝母、川貝母、青貝、爐貝、濃蜜貝母8種貝母進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè),結(jié)果表明,只有青貝、爐貝與引物有特異性的結(jié)合位點(diǎn),不同產(chǎn)地的平貝母、、浙貝母、湖北貝母、伊貝母、濃蜜貝母與引物無特異性的結(jié)合位點(diǎn)。因此通過對(duì)8種貝母進(jìn)行PCR分析,川貝母與其他貝母的DNA分子差異,實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性較好,為進(jìn)一步發(fā)掘和充分利用貝母資源提供理論依據(jù)。
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