[摘要]該研究應(yīng)用ITS2序列鑒別牡丹皮藥材及其混偽品，以期探索牡丹皮藥材準(zhǔn)確鑒別的新方法。提取牡丹皮及其混偽品的DNA，目標(biāo)片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后測(cè)序，通過(guò)CodonCode Aligner V3.7.1對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)量分析和拼接，基于MEGA 5.0中的K2P模型計(jì)算牡丹皮與其混偽品的種內(nèi)、種間遺傳距離及構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(shù)。牡丹皮ITS2序列長(zhǎng)度為227 bp，種內(nèi)最大K2P距離為0，它與各混偽品的種間最小K2P距離為0.041，種間平均K2P距離為0.222。由NJ樹(shù)可知：不同產(chǎn)地來(lái)源的牡丹皮藥材個(gè)體聚為一支，自展支持率為99%，呈現(xiàn)出明顯的單系性，能很好地與其混偽品芍藥、川赤芍、白鮮皮、朱砂根區(qū)分開(kāi)來(lái)。應(yīng)用ITS2序列可以準(zhǔn)確鑒別牡丹皮藥材及其混偽品，該方法可以作為傳統(tǒng)鑒別方法的有效補(bǔ)充。
　　[關(guān)鍵詞]牡丹皮；混偽品；ITS2；鑒別
　　牡丹皮為毛茛科芍藥屬植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮^[1]，但在我國(guó)有些地區(qū)，卻將其同屬植物芍藥P. lactiflora Pall.和川赤芍P. veitchii Lynch、蕓香科植物白鮮Dictamnus dasycarpus Turcz.以及紫金�？浦参镏焐案鵄rdisia crenata Sims的干燥根皮作牡丹皮使用^[2-9]�，F(xiàn)代藥理研究表明，牡丹皮具有抗菌、抗病毒、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心律失常等多種藥理作用^[10-12]。但它的混偽品僅含少量甚至不含其主要活性成分丹皮酚（paeonol）^[13-15]，它們的混用必然會(huì)影響牡丹皮藥材的使用、研究和開(kāi)發(fā)。而依靠傳統(tǒng)的性狀、顯微和理化鑒別方法既要求操作人員具有較深厚的專業(yè)知識(shí)，又難以將易混藥材準(zhǔn)確鑒別到種，這并不適應(yīng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的要求。
　　近年來(lái)，DNA條形碼（DNA barcoding）技術(shù)以其通用性強(qiáng)、易數(shù)字化等優(yōu)點(diǎn)，迅速成為生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)。它是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的、有足夠變異但兩端相對(duì)保守的序列進(jìn)行物種鑒定的分子診斷新技術(shù)^[16]。在中藥鑒定領(lǐng)域，中國(guó)學(xué)者已提出將ITS2 （internal transcribed spacer 2）序列作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列^[17-23]。本研究應(yīng)用ITS2序列鑒別牡丹皮及其混偽品，以期探索牡丹皮藥材準(zhǔn)確鑒別的新方法。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料 本研究通過(guò)實(shí)地采集、藥材市場(chǎng)購(gòu)買等方式收集未經(jīng)炮制的牡丹皮及其混偽品樣本51份，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所。另從GenBank中下載7條序列（登錄號(hào)為GQ434607，GQ434600，GQ434601，GQ434602，GQ434603，GQ434841，GQ434842）。樣本信息詳見(jiàn)表1。
　　1.2 模板DNA的制備 刮去牡丹皮藥材及其混偽品的外表皮，取其內(nèi)部組織約40 mg；加入10% PVP40（原植物葉片中不加），用高通量組織研磨儀（scientz-48，China）在50 Hz條件下研磨120 s；利用植物DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，中國(guó)）提取總DNA。提取過(guò)程中，向藥材粉末中加入細(xì)胞裂解液，56 ℃水浴過(guò)夜；用氯仿-異戊醇（24∶1）抽提2次；在進(jìn)行沉淀DNA操作時(shí)將沉淀劑改為-20 ℃預(yù)冷的異丙醇^[24]。
　　1.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 ITS2通用引物：正向引物S2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物S3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，正反向引物（2.5 μmol·L-1）各1.0 μL，總DNA 2 μL，加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s（進(jìn)行40個(gè)循環(huán)）；72 ℃延伸10 min^[25]。電泳檢查PCR擴(kuò)增情況，產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行雙向測(cè)序。
　　1.4 數(shù)據(jù)處理 對(duì)獲得的測(cè)序序列使用CodonCode Aligner V3.7.1 （Codon Code Co.，USA ）進(jìn)行質(zhì)量分析和拼接，去除引物區(qū)；采用注釋方法（基于隱馬爾科夫模型）去除所得序列的5.8S端和28S端以獲得ITS2間隔區(qū)序列（從GenBank中下載的7條序列均為完整的ITS2序列，不必注釋）；將所有ITS2序列用MEGA（molecular evolutionary genetics analysis）5.0進(jìn)行分析比對(duì)，并基于K2P模型（Kimura 2-parameter model）進(jìn)行遺傳距離分析及采用鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(shù)^[26]。
　　2 結(jié)果與分析
　　2.1 牡丹皮的種內(nèi)序列分析 牡丹皮藥材不同產(chǎn)地樣本共20條序列，比對(duì)后長(zhǎng)度為227 bp，平均GC含量為59.0%，種內(nèi)無(wú)變異位點(diǎn)，種內(nèi)最大K2P距離為0。
　　2.2 牡丹皮與其混偽品的種間序列分析 芍藥17條序列，比對(duì)后長(zhǎng)度為227 bp，平均GC含量為57.1%；川赤芍7條序列，比對(duì)后長(zhǎng)度為228 bp，平均GC含量為56.7%；朱砂根7條序列，比對(duì)后長(zhǎng)度為217 bp，平均GC含量為59.1%；白鮮皮10條序列，比對(duì)后長(zhǎng)度為222 bp，平均GC含量為63.9%。牡丹皮藥材與各混偽品的ITS2序列種間最小K2P距離為0.041，種間平均K2P距離為0.222。本研究中，牡丹皮與其最常見(jiàn)混偽品芍藥的3種單倍型的ITS2序列間變異情況見(jiàn)表2。

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