摘要：為較全面的了解云南復(fù)烤煙葉在不同地點醇化過程中真菌多樣性，挖掘其中的有益微生物，提高煙草醇化品質(zhì)，以復(fù)烤煙葉為試驗材料，利用18S rDNA克隆測序技術(shù)，系統(tǒng)研究了其醇化過程中可培養(yǎng)真菌的種群結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，醇化過程中，復(fù)烤煙葉葉面真菌數(shù)量除曲靖倉庫在6月有所上升外，其余各地均隨著醇化的進行而逐漸下降，其中曲靖和楚雄兩地非常接近，元江最少；通過形態(tài)特征及18S rDNA鑒定，煙葉葉面真菌包括根霉屬真菌、青霉屬真菌、曲霉屬真菌等24個真菌屬（種）。不同地點，不同時期煙葉葉面真菌的數(shù)量、種類及優(yōu)勢種群不盡相同，而根霉屬真菌始終為優(yōu)勢種群。
　　關(guān)鍵詞：復(fù)烤煙葉；醇化；真菌：18S rDNA
　　煙葉是一種經(jīng)濟價值較高的商品，是卷煙工業(yè)的主要原料。由于當年復(fù)烤的煙葉存在刺激性大、青雜氣重、煙氣粗糙、余味澀口、香氣不夠顯露等特點，不適宜直接進行卷煙生產(chǎn)，需經(jīng)過一段時間的醇化來改善煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)性及評吸質(zhì)量，從而達到生產(chǎn)標準。在煙葉醇化過程中，微生物及其產(chǎn)生的酶發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用微生物不僅可以通過自身的生命活動作用于煙葉醇化過程，還可通過其代謝產(chǎn)生的生物酶參與煙葉的生理生化反應(yīng)，促進煙葉中生物大分子的轉(zhuǎn)化。有研究表明，將微生物或酶用于煙葉醇化可縮短醇化時間，提高煙葉品質(zhì)和改善煙氣特性。相反，如果醇化過程中某類微生物過度繁殖，則會影響煙葉醇化品質(zhì)，后續(xù)的卷煙生產(chǎn)及質(zhì)量控制。因此，研究醇化過程中微生物的變化規(guī)律，對調(diào)控微生物作用，提高醇化效率，乃至揭示煙葉醇化機理具有重要意義。關(guān)于煙葉醇化過程中微生物變化已有不少研究，但關(guān)于復(fù)烤煙葉不同地點醇化其葉面微生物的變化卻鮮有報道。
　　云南是我國煙草原料大省，然而云南立體氣候特點明顯、不同地區(qū)生態(tài)條件差異顯著，勢必影響到微生物群落結(jié)構(gòu)差異，從而對煙葉醇化品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。但目前尚未見關(guān)于云南復(fù)烤煙葉不同地點醇化過程中葉面可培養(yǎng)真菌群落結(jié)構(gòu)的比較研究。基于此，本研究對置于彌勒、曲靖、元江、楚雄4地的紅花大金元復(fù)烤煙葉葉面可培養(yǎng)真菌數(shù)量、種類及其動態(tài)變化規(guī)律進行研究，為進一步研究煙葉醇化機理和人工調(diào)控?zé)熑~醇化進程提供依據(jù)。
　　1材料與方法
　　1.1供試材料
　　本試驗所用的煙葉為紅云紅河集團及紅塔集團2014年的紅花大金元復(fù)烤煙葉，共選取7個樣品進行試驗，分別為昆明WDB2F及WDC3F、曲靖WDC3F及WBBSF、紅河WDC3F及WBBSF、大理VC02S。
　　1.2醇化地點及氣候條件
　　所有供試紅花大金元（簡稱紅大，HD）復(fù)烤煙葉樣品均分別入庫彌勒、曲靖、元江和楚雄4個倉儲地。彌勒煙葉倉庫的年平均氣溫19.8℃、濕度為73.3%，曲靖煙葉倉庫的年平均氣溫19.8℃、濕度為58.2%，元江煙葉倉庫的年平均氣溫24.36℃、濕度為65%，楚雄煙葉倉庫的年平均氣溫20.5℃、濕度為59.6%。
　　1.3取樣及真菌分離
　　于2015年4、10月：2016年1、7、9月于每個醇化地同步采集自然醇化了0、6、9、15和17個月的煙草樣品，采用無菌袋（1500 g/袋）密封包裝，每地7個樣，共140個樣品，測定煙葉葉面真菌種類及數(shù)量。
　　在無菌條件下，從每個煙葉樣品中隨機選取50個煙葉片段，然后用無菌剪刀剪成1cmx1cm大小組織塊，并從中隨機取30個組織塊貼于PDA平板上（10個組織塊/平板，平板直徑為90mm），28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～55 d，隔天觀察，發(fā)現(xiàn)組織塊周圍有真菌長出，則將其挑取并轉(zhuǎn)接到新鮮PDA平板上，純化后接于PDA斜面進行分類、鑒定及保藏。
　　1.4菌株鑒定
　　1.4.1形態(tài)學(xué)鑒定根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、生長速率、質(zhì)地和分泌物狀態(tài)與顏色等，將分離得到的真菌分為不同的形態(tài)類群（morphotype）之后，從各類群中隨機挑取3-5株接種于PDA平板上，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，通過對孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)與大小、產(chǎn)孢方式與產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征來確定菌株的分類地位。對于不產(chǎn)孢的菌株，則進行促孢培養(yǎng)，產(chǎn)孢后按上述方法進行鑒定。對于利用各種方法促孢后仍然不產(chǎn)孢的類群，則依據(jù)菌落質(zhì)地、顏色、生長速率，菌絲顏色、粗細和結(jié)構(gòu)等特征劃分為不同的無孢類群組（mycelia sterile）。
　　1.4.2分子鑒定
　　對于那些不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢后仍不能確定其分類地位的菌株，則通過測定其18S rDNA序列，并與Genebank上的序列比對后，再結(jié)合其形態(tài)特征來確定其分類地位。具體做法為：將供試菌株從斜面轉(zhuǎn)接到PDA平板上進行活化，采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化銨法）提取菌株基因組DNA。隨后利用真菌ITS通用引物ITSl（5"-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5"-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3"）進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，合格后送碩擎生物科技有限公司進行測序。所得序列與NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的序列進行比對，根據(jù)覆蓋率和相似度并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定其分類地位。
　　2結(jié)果
　　2.1煙葉葉面可培養(yǎng)真菌數(shù)量及其動態(tài)變化
　　從彌勒、曲靖、元江、楚雄4個醇化地、5個不同醇化時間點的140個煙葉樣品的4200個煙葉片段中，共分離得到1636株真菌，其在醇化過程中各醇化地的分布及變化見圖1。由圖1可知，煙葉經(jīng)過一段時間的醇化后，除曲靖和楚雄兩地在醇化9個月后煙葉葉面真菌數(shù)量非常接近外，各醇化地?zé)熑~葉面真菌數(shù)量差異較大，但總體而言，在各個醇化時間點都是元江煙葉葉面的真菌數(shù)量低于其他3個醇化地（醇化17個月后略高于彌勒）。且除曲靖醇化煙葉葉面真菌數(shù)量在醇化6個月時有所上升外，各醇化地?zé)熑~葉面真菌的數(shù)量均隨著醇化時間的延長而降低。
　　2.2煙葉葉面可培養(yǎng)真菌種類及其動態(tài)變化

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